Notes

Deep Seek

Sekonder Lenfoid Organlar (SLO'lar), vücutta bademcikler, lenf düğümleri, dalak ve Peyer plakları şeklinde stratejik olarak dağılmıştır. Bu organlar, gözetim merkezleri olarak işlev görür ve adaptif bağışıklık yanıtlarının başlatılması için gerekli özelleşmiş mikro ortamı sağlar. Stromal hücrelerin karmaşık bir ağı ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş kimyasal sinyaller aracılığıyla, çeşitli bağışıklık hücre tiplerinin etkileşimini kolaylaştırır. Bu etkileşim, yüksek afiniteli antikor salgılayan plazma hücreleri ve bellek B hücrelerinin oluştuğu germinal merkezlerin (GC'ler) oluşumuyla sonuçlanır.
Doğuştan gelen bağışıklık hataları (IEI'ler) olan hastalar, örneğin BTK, RAG1 ve RAG2 eksiklikleri gibi durumlarda, ele gelmeyen lenf düğümleri ile karşılaşabilirler. Ancak bu durumlarda, stromal kompartman normal şekilde gelişir ve lenf düğümü yapıları oluşur, ancak bu yapılar lenfositler tarafından doldurulmaz. Başarılı bir hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) sonrasında, bu lenf düğümleri düzgün bir şekilde organize olabilir ve işlev görebilir.
Bununla birlikte, lenfositik kompartmanlardaki kusurların ötesinde anormal SLO gelişimi gösteren nadir IEI vakaları da vardır. Nükleer faktör κB (NF-κB) indükleyici kinaz (NIK) eksikliği olan hastalarda lenf düğümü aplazisi görülürken, 40S ribozomal protein SA (RPSA) eksikliği izole konjenital aspleni ile karakterizedir. NIK, her yerde bulunur ve dolayısıyla lenfosit fonksiyonunu ve gelişimini doğrudan etkiler, oysa RPSA eksikliği lenf düğümü mimarisini veya dalak dışındaki diğer lenfoid organları etkilemez. Bildiğimiz kadarıyla, SLO'ların stromal mimarisini bozarak IEI'ye neden olan izole bir kusur tanımlanmamıştır.
NF-κB, hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık sistemlerinde immün ve inflamatuar yanıtların koordinasyonundan lenfoid organların gelişimi ve bakımına kadar kritik roller oynayan bir transkripsiyon faktörleri ailesidir. T hücre reseptörü (TCR), B hücre reseptörü (BCR), Toll benzeri reseptörler ve tümör nekroz faktörü (TNF) süper ailesinin üyeleri dahil olmak üzere birçok reseptör, immün hücrelerde NF-κB sinyalini aktive edebilir. TNF süper ailesinin bir üyesi olan lenfotoksin beta reseptörü (LTβR), esas olarak endotelyal, mezenkimal ve epitelyal hücreler gibi stromal hücreler tarafından ve dendritik hücreler (DC'ler) ve makrofajlar dahil miyeloid hücreler tarafından eksprese edilir. Buna karşılık, iki ligandı olan lenfotoksin (LT) ve TNF süper ailesi üyesi 14 (TNFSF14/LIGHT), esas olarak aktive edilmiş lenfositler ve lenfoid doku indükleyici hücreler üzerinde eksprese edilir. Bu indükleyici hücrelerin, farelerde embriyonik gelişim sırasında lenf düğümü oluşumu için gerekli olduğu gösterilmiştir. Ligand bağlanması üzerine, LTβR hem kanonik NF-κB yolunu hem de daha büyük ölçüde nonkanonik NF-κB yolunu aktive eder. LTβR'nin bağışıklık sisteminin gelişimi ve düzenlenmesindeki kilit rolü, stromal hücreler ve lenfositler arasındaki sıkı iletişim yoluyla fare modellerinde ortaya konmuştur. LTβR'nin eksikliği veya inhibisyonu, lenf düğümlerinin ve Peyer plaklarının olmamasına ve dalak mimarisinin bozulmasına neden olur. Bununla birlikte, LTβR sinyalizasyonunun insanlardaki rolü hala tam olarak tanımlanmamıştır. Burada, LTβR'yi etkileyen biallelik fonksiyon kaybı (LOF) mutasyonlarından kaynaklanan bir IEI vakasını bildiriyoruz ve fare çalışmalarında daha önce fark edilmemiş olan LTβR sinyalizasyonunun, insanlarda SLO'ların mikro mimarisini ve immünolojik işlevlerini şekillendirmedeki stromal hücre fonksiyonunu yönettiğini ortaya koyuyoruz.
BULGULAR
Lenf düğümü ve bademcik aplazisi ile dalak kusuru olan bir IEI.
İki akraba olmayan akraba aileden (Şekil 1A) üç erkek hastayı (P1'den P3'e) inceledik. Bu hastalar, doğumdan 4 ila 6 ay sonra başlayan ve çoğunlukla bakteriyel etiyolojiye sahip olan ve intravenöz antibiyotik tedavisi gerektiren tekrarlayan üst ve alt solunum yolu enfeksiyonları yaşıyorlardı. 3 yaşındayken, P1 Streptococcus pneumoniae'nin neden olduğu menenjit geçirdi ve tamamen iyileşti. P2, 9 yaşında akut hepatit geçirdi. Nedensel bir ajan tespit edilemedi ve karaciğer biyopsisi safra yolu tahribatını ortaya çıkardı (Şekil S1A). Hastanın biyopsisinde, Ltbr−/− farelerde gözlemlenen lenfoid infiltratları hatırlatan CD4+ T hücreleri ve B hücrelerinin yanı sıra bazı CD8+ T hücrelerinin birikimi tespit ettik. Antibiyotik tedavisi ve kolesistektomi sonrasında hasta akut hepatit semptomları göstermedi. P3'ün abisi benzer hastalık belirtileri gösterdi ve 18 yaşında pulmoner hipertansiyon ve kor pulmonale dahil olmak üzere hastalık komplikasyonları nedeniyle hayatını kaybetti. Tekrarlayan enfeksiyonlara rağmen, hastaların hiçbirinde lenfadenopati tespit edilmedi ve fizik muayenede bademciklerin olmaması ve ele gelmeyen lenf düğümleri dikkat çekiciydi. Klinik öyküler Tablo 1 ve ek hasta klinik öykülerinde özetlenmiştir.
P1'den P3'e yapılan lenfosintigrafi, normal lenfatik kanal gelişimine rağmen tam lenf düğümü aplazisini gösterdi (Şekil 1B ve Şekil S1B). Ultrasonografik incelemede dalak normal boyut ve morfolojiye sahipti, ancak periferik kan yaymalarında Howell-Jolly cisimcikleri şiddetli fonksiyonel hiposplenizmi işaret ediyordu (Şekil 1C ve Şekil S1C). Ek olarak, makrofajlar ve DC'ler tarafından splenik uzaklaştırmadan korunmak için hücreler tarafından kullanılan bir sinyal olan CD47 ekspresyonu, P1'den P3'e kadar olan hastalarda azalmıştı, bu da LTβR eksikliği olan hastalarda gözlemlenen bozulmuş dalak fonksiyonunu daha da vurguluyordu (Şekil 1D).
Laboratuvar çalışmaları, P1'den P3'e kadar olan hastalarda immünoglobulin A (IgA) ve IgG düzeylerinin düşük olduğunu ortaya koydu (Tablo 1). IgM düzeyleri P1 ve P2'de yaşa göre ayarlanmış normal aralığın altındaydı, ancak P3'te normaldi. Kombine immün yetmezlik klinik tanısı konulduktan sonra, P1'den P3'e düzenli intravenöz immünoglobulin (IVIG) replasmanı ve antibiyotik profilaksisi başlatıldı, bu da solunum yolu enfeksiyonlarının alevlenmelerini azalttı. P1, epidermodisplazi verruciformis ve cilt kanseri ile ilişkili olan β human papillomavirus tip 24 (HPV-24) için DNA pozitif çıktı (Şekil 1E). Diğer kalıcı viral enfeksiyonlar gözlemlenmedi (Tablo 1 ve ek hasta klinik öyküleri). Toplu olarak, bu sonuçlar, tam lenf düğümü ve bademcik aplazisi ile dalak kusuru olan bir bağışıklık hatasını ortaya koymaktadır.
Ekspresyon kaybına ve bozulmuş nonkanonik NF-κB sinyalizasyonuna neden olan biallelik germline LTBR mutasyonları
Gizemli hastalık etiyolojisi göz önüne alındığında, P2 ve P3'ün tam ekzon dizilemesini (WES) gerçekleştirdik (Şekil S2 ve Tablolar S1-S4) ve otozomal resesif kalıtım varsayımı altında hastalıkla birlikte segrege olan lenfotoksin beta reseptörü (LTBR) geninde nadir homozigot varyantlar bulduk (Şekil 1A ve Şekil S3A). P1 ve P2'deki LTBR varyantı, ekzon 1'de erken bir stop kodonu (c.91C>T, p.Gln31Ter) oluştururken, P3, ikinci sistein bakımından zengin alanda bir döngüde bulunan ve yer değiştiren prolin kalıntısının sterik çarpışmaları nedeniyle proteini destabilize etmesi öngörülen bir missense varyant taşır (c.359G>C, p.Arg120Pro) (Şekil S3B ve S3C). Tanımlanan varyantlar, kamu veritabanlarında ya yoktu ya da çok nadirdi (allel frekansı < 0.00001), LTBR kısıtlaması metrikleriyle tutarlıydı --- gözlemlenen varyasyon/beklenen varyasyon oranına dayalı negatif seleksiyonun bir ölçüsü --- hem missense hem de LOF varyasyonlarına karşı hoşgörüsüzlüğe işaret ediyordu. In siliko tahminler, bu varyantların muhtemelen zararlı etkileri olduğunu öne sürdü (Tablo S5).
P1 ve P2'nin serum analizi, SLO'larda yüksek oranda eksprese edilen ve B hücrelerinin navigasyonunu kontrol eden bir kemokin olan B lenfosit kemoattractant (CXCL13/BLC) düzeylerinde bir azalma gösterdi (Şekil 1F ve Şekil S4, A-C). CXCL13, LTβR aktivasyonundan sonra salgılanır ve LTβR antagonistlerinin klinik denemelerinde başarılı LTβR inhibisyonunun bir serum biyobelirteci olarak kullanılmıştır. P1'den P3'e kadar olan hastaların dermal fibroblastlarında LTβR protein ekspresyonu tamamen yoktu (Şekil 1G). LTβR, ligandı LT'ye bağlandığında, nonkanonik NF-κB yolunu aktive eder ve bu sırada öncül p100, aktif p52 formuna işlenir. Buna göre, hasta kaynaklı fibroblastların LT ile tedavisi, p52'nin yukarı regülasyonunu sağlayamadı (Şekil 1H ve Şekil S5A). Buna karşılık, TNF-α tarafından indüklenen kanonik NF-κB yolunun aktivasyonu bozulmadan kaldı (Şekil S5B). CRISPR-Cas9 kullanılarak P1 ve P3'ün fibroblastlarında stop-gain varyantının düzeltilmesi, hem LTβR ekspresyonunu hem de LT ile indüklenen p100'ün p52'ye işlenmesini geri yükledi (Şekil 1, G ve H, ve Şekil S5, A ve C). Böylece, bu sonuçlar, varyantların LOF olduğunu ve gözlemlenen anormal nonkanonik NF-κB sinyalizasyonuna neden olduğunu göstermektedir.
Bellek B hücreleri ile düzenleyici ve TFH hücrelerinin eksikliği
P1'den P3'e kadar olan hastaların seri laboratuvar analizleri, toplam lökosit ve lenfosit sayılarının normal aralıkta olduğunu ortaya koydu (Tablo 1). LTβR'nin B ve T lenfositlerinde bulunmamasına ve terminal B hücresi olgunlaşmasının esas olarak SLO'larda gerçekleşmesine rağmen, B hücresi farklılaşmasının bozulmuş olabileceğini varsaydık. Buna uygun olarak, CD19+ B hücrelerinin toplam sayıları normal olmasına rağmen, GC benzeri B hücrelerinde önemli bir azalma tespit ettik (Şekil 2A), ayrıca hem sınıf değiştirmiş hem de değiştirmemiş bellek B hücrelerinin neredeyse tamamen yokluğu (Şekil 2B ve Şekil S6) ve IgA+ veya IgG+ B hücrelerinin eksikliği (Şekil S7A). T-bethighCD21low B hücrelerinin genişlemesi, belirli enfeksiyonlarda veya otoimmün bozukluklarda adaptif bağışıklık sisteminin kronik aktivasyonunun bir işaretidir ve bu sayılar IEI'li hastalarda anormal olabilir (28). Bununla birlikte, hem P2 hem de P3, sağlıklı kontrollerle (HC'ler) karşılaştırıldığında benzer sayıda T-bethighCD21low B hücresi sergiledi (Şekil S7B). In vitro sitokin stimülasyonundan sonra, hasta B hücreleri normal aktivasyon, proliferasyon ve prensipte IgA- veya IgG-pozitif hücrelere sınıf değiştirme yeteneği gösterdi (Şekil S8). B hücresi disfonksiyonuna T hücrelerinin katkısını değerlendirmek için, LTβR eksikliği olan hastalarda T hücresi kompartmanını ve fonksiyonunu analiz ettik. Fare çalışmaları, LTβR sinyalizasyonunun timik epitelyal hücreler ve stromal hücrelerin düzenlenmesindeki rolünü göstermiştir (18, 29). P1 ve P2 daha düşük TCR eksizyon dairesi (TREC) seviyeleri göstermesine rağmen, toplam T hücre sayıları normal aralıktaydı (Tablo 1) ve P1-P3'ün son timik göçmen oranları HC'lerle benzerdi (Şekil S9A). CD4+ T hücre alt popülasyonları etkilenmezken, P1 ve P2'de CD45RA'yı yeniden eksprese eden CD8+ terminal diferansiye efektör bellek T hücreleri (TEMRA) artmıştı (Şekil 2C), bu durum kronik antijenik maruziyetle ilişkili olabilir (30). Düzenleyici T (Treg) hücreleri ve foliküler yardımcı T (TFH) hücreleri P1-P3'te belirgin şekilde azalmıştı (Şekil 2D ve 2E). Fare çalışmaları, LT'nin T yardımcı (TH) hücre farklılaşması üzerindeki etkisi konusunda çelişkili sonuçlar göstermiştir. LT, TH1 hücre yanıtlarıyla ilişkilendirilen prototipik bir sitokin olarak tanımlanırken, LTβR veya ligandı eksik farelerde dalak ve akciğerlerde TH1 tipi sitokin seviyelerinin yükseldiği gözlemlenmiştir (32). Buna karşılık, Leishmania major enfeksiyonuna maruz kalan Ltbr−/− farelerde TH2 hücre polarizasyonuna yönelim artmış ve sistemik enfeksiyonun şiddeti yükselmiştir. Lenfositlerin stimülasyonu ve sitokin üretiminin değerlendirilmesi, P1-P3'te interlökin-4 (IL-4) üreten TH2 hücrelerinde belirgin bir azalma ve interferon-γ (IFN-γ) üreten TH1 ile IL-17A üreten TH17 hücrelerinde düşüş eğilimi olduğunu ortaya koydu (Şekil 2F). P1 ve P2 T lenfositleri, proliferasyon ve aktivasyon testleri dahil çeşitli in vitro fonksiyonel deneylerde HC'lerinkine benzer işlevsellik sergiledi (Şekil S9B ve S10).
P1 ve P2'nin lenfositlerinin tek hücreli RNA dizilemesi (scRNA-seq), CD8+ kompartmanında efektör bellek hücrelerine kayma ve Treg hücre oranlarında azalma olduğunu doğruladı (Şekil 3A, 3B ve Şekil S11). CD8+ T lenfositlerinde en belirgin şekilde down-regüle olan genler arasında, LTβR'nin ana ligandı olan lenfotoksin heterotrimeri LTα1β2 veya LTα2β1'i oluşturmak üzere LT-α'ya bağlanan lenfotoksin-β (LT-β) kodlayan LTB ve antijenik aktivasyona yanıtta önemli rol oynayan FOS bulunuyordu (Şekil 3C). Her iki hastada da tekrarlayan enfeksiyon öyküsüne rağmen, gen ekspresyon analizi kronik inflamasyon ve tükenme yollarıyla ilişkili genlerde belirgin farklılıklar göstermedi (Tablo S6). Toplu TCR dizileme (Şekil 3D) ve scRNA-seq analizi (Şekil S12), P1 ve P2'nin T hücrelerinde çeşitliliğin azaldığını gösterdi; ancak bu durum, poliklonal bir zeminde birkaç klonun genişlemesinden kaynaklanıyordu. Bu bulgular, T hücrelerinin tekrarlayan antijenik uyarıma rağmen nispeten hareketsiz bir durumu yansıtan efektör bellek popülasyonuna kaydığını ve kısıtlı bir klonotip düzenine sahip olduğunu doğruladı. Hasta lenfositlerinin in vitro fonksiyonlarının korunması, ancak in vivo farklılaşmanın bozulması, bu alt popülasyon değişikliklerinin lenfositlerin kendisindeki bir kusurdan değil, hastaların stromal kompartmanları ve SLO'larındaki bozukluklardan kaynaklandığını düşündürmektedir.
LTβR ve TNF Ağındaki Değişiklikler
ScRNA-seq'de P1 ve P2'nin CD8+ hücre alt tiplerinde LTB ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını fark ettikten sonra (Şekil 3C), P2 ve P3'ün serum LTB seviyelerini ölçtük ve bu seviyelerin HC'lere kıyasla belirgin şekilde düşük olduğunu gözlemledik (Şekil 4B). Ardından TNF ailesinin diğer üyelerini de değerlendirdik. Serum analizi, P1 ve P2'de TNF-α'da hafif bir artış (Şekil 4A ve Şekil S13A) ve P1'de TNF-β (LT-α'nın çözünür homotrimeri) artışı olduğunu gösterdi (Şekil 4A). LTβR'nin diğer bilinen ligandı olan TNF süper aile üyesi 14 (TNFSF14/LIGHT) da P1 ve P2'nin serumunda yükselmişti (Şekil 4A), bu durum tüm üç hastada ELISA ile doğrulandı (Şekil 4C). Ek olarak, Fas ligandı (FasL) seviyeleri de hastalarda artmıştı (Şekil 4D). TNF-α ve TNF-β/LTα3 gibi, LIGHT ve FasL de apoptozu indükleyebilir. Farelerde LIGHT'ın aşırı ekspresyonu otoimmüniteye yol açar ve insanlarda LIGHT veya FasL yüksekliği otoimmünite ile ilişkilendirilir. Önceki çalışmalarda, Ltbr−/− fareler splenomegali, otoantikor üretimi ve lenfositik infiltratlar ile karakterize immün düzensizlik fenotipi sergilemiştir. Ancak kohortumuzdaki hiçbir hastada klinik otoimmünite veya otoinflamasyon gözlenmedi. Hastaları kapsamlı otoantikor panelleri ile taradık; P1 ve P2 negatifken, P3 normal karaciğer ve böbrek parametrelerine rağmen anti-Ku ve anti-mitokondriyal antikorlar (AMA-M2) pozitif çıktı (Tablo 1), bu da bu antikorların şimdiye kadar klinik belirtiye veya organ tutulumuna yol açmadığını gösterdi. Nonkanonik NF-κB yolunu etkileyen monojenik IEI'lerde tip I IFN'lara karşı otoantikorlar bildirilmiş olsa da, P3'ün serumunda bu antikorlar tespit edilemedi (Tablo 1).
Ayrıca, hastaların serumunda sağlıklı kontrollere kıyasla artmış dekoy reseptör 3 (DcR3/TNFRSF6B) seviyeleri gözlendi (Şekil 4E ve Şekil S13B). DcR3, hem LIGHT hem de FASL'i inhibe ederek anti-inflamatuar etki gösteren çözünür bir proteindir. Beklenmedik şekilde, ticari IVIG ürünlerinin çeşitli örneklerinde de DcR3 tespit ettik (Şekil 4D ve Şekil S13B-C). Ayrıca, bir IEI hastasının IVIG tedavisi sonrası serum DcR3 seviyelerinin arttığını gözlemledik (Şekil S13C). Önceki çalışmalar, DcR3 üretiminin PI3K/NF-κB aktivasyonuyla ilişkili olduğunu göstermiştir (45). Dermal fibroblastların TNF-α veya TNF-β/LTα3 ile tedavisi, DcR3 salınımını indükledi (Şekil 4F), aynı etki lenfotoksinin iki izoformu olan LTα1β2 ve LTα2β1 ile de gözlendi. Bu etki, sırasıyla TNFR1 ve LTβR stimülasyonuna bağlıydı çünkü ek TNFR1 knockout'lu P2 fibroblastları ligandlara yanıt vermedi. LTα2β1 her iki reseptöre de bağlanabilirken, LTα1β2 yalnızca LTβR'ye bağlanır (46). Buna göre, LTα1β2 hasta kaynaklı fibroblastlarda etkisizken, LTα2β1 HC'lerde olduğu gibi DcR3 üretimini indükledi. DcR3'ün immünomodülatör işlevini değerlendirmek için, besleyici hücrelerle genişletilmiş T hücrelerini DcR3 ile tedavi ettik. Bu tedavi, T hücrelerini aktivasyon kaynaklı hücre ölümünden (AICD) korudu (Şekil 4G) ve sitotoksik öldürme gibi efektör fonksiyonlarını azalttı (Şekil 4H). DcR3'ün kodlayan geni insan genomunda mevcut olsa da, farelerde bir ortologu yoktur (43). Toplu olarak, bu veriler LTβR eksikliği olan hastalarda TNF süper ailesinin çeşitli üyelerinin düzensizliğini ortaya koymaktadır.