Notes

Abstrak
Pirogen adalah agen penyebab demam dan peradangan yang menyebabkan bahaya kesehatan yang serius, terutama dalam kasus obat intravena dan produk farmasi. Sementara lipopolisakarida (LPS) dari membran luar bakteri Gram-negatif tetap menjadi pirogen prototipe, zat seperti asam lipoteikoat (LTA) dan peptidoglikan dari bakteri Gram-positif dan lainnya semakin dikenal sebagai rangsangan kekebalan yang ampuh. Kehadiran pirogen dalam tubuh memulai sekresi sitokin proinflamasi oleh monosit. Ketika konsentrasi pirogen yang tinggi memasuki aliran darah, mereka menyebabkan demam, syok septik atau bahkan kematian. Kehadiran sejumlah kecil endotoksin dalam preparat protein rekombinan dapat menyebabkan efek samping pada organisme inang seperti syok endotoksin, cedera jaringan, dan bahkan kematian. Karena reaksi ini, penting untuk menghilangkan endotoksin dari obat-obatan, suntikan, dan produk biologi dan farmasi lainnya. Depirogenasi mengacu pada penghilangan pirogen dari larutan, paling sering dari obat-obatan suntik. Studi depirogenasi adalah uji biologis utama, selain uji termometri, untuk kualifikasi perangkat depirogenasi. Depirogenasi dapat didefinisikan sebagai penghilangan semua zat pirogenik, termasuk endotoksin bakteri, dan umumnya dicapai dengan penghilangan atau inaktivasi. Depirogenasi, seperti sterilisasi, adalah istilah absolut yang hanya dapat dibuktikan secara teoritis karena ketidakpekaan pengujian. Karena hampir semua bahan baru yang terlibat dalam proses produksi, termasuk karyawan pabrik, dapat menjadi sumber potensial kontaminasi pirogen, penyaringan bahan baku dan depirogenasi seringkali dapat sangat membantu untuk memastikan bahwa produk akhir bebas dari pirogen dan tidak memerlukan pemindahan yang mahal. atau inaktivasi pirogen. Tinjauan saat ini memberikan pembahasan rinci tentang konsep teoritis dan mekanisme depirogenasi.


Pyrogenisitas
Pirogen adalah agen penyebab demam dan peradangan yang menyebabkan bahaya kesehatan yang serius, terutama dalam kasus obat intravena dan produk farmasi. Satu-satunya badan pengatur di A.S. yang memerlukan studi pyrogenicity adalah Food and Drug Administration (FDA, 2012). Produk farmasi yang ditujukan untuk penggunaan parenteral harus bebas dari pirogen, yang dapat berasal dari bakteri, virus, dan jamur Gram-negatif atau Gram-positif. Exdotoxins lipopolysaccharides, LPS) dari bakteri Gram-negatif umumnya ditemukan dalam obat-obatan parenteral dan alat kesehatan dan ditemukan dalam perhatian khusus pada industri farmasi. Endotoksin adalah kompleks dengan berat molekul besar yang terkait dengan, dan dilepaskan dari, membran luar bakteri Gram-negatif. (Westphalia, 1975). Endotoksin terdiri dari tiga wilayah kimia yang berbeda: bagian lipid (lipid A) yang terkait dengan inti polisakarida yang, pada gilirannya, terkait dengan rantai samping antigenik-O. Setiap endotoksin menyajikan komposisi dan struktur variabel yang mempengaruhi fungsi dan aktivitas biologisnya; Fungsi endotoksin meliputi induksi demam dan protein fase akut, sakit kepala, dan syok hipotensi berat. Ada bukti kuat bahwa respon demam terhadap virus pirogen eksogen (misalnya endotoksin) dimediasi oleh pirogen endogen, yaitu pirogen yang dihasilkan oleh inang. Pirogen endogen memiliki aktivitas pirogenik dan inflamasi yang kuat dan termasuk interleukin 1-Alfa (IL_1Alfa), interleukin-1Beta (IL-1Beta), faktor nekrosis tumor Alfa (TNF-Alfa) dan interleukin-6 (IL-6). Reaksi pirogenik dan syok diinduksi pada mamalia setelah injeksi endotoksin intravena pada konsentrasi rendah (1 ng / mL) (Fiske, et al., 2001). Tingkat maksimum endotoksin untuk aplikasi intravena produk farmasi dan biologi ditetapkan hingga 5 unit endotoksin (UE) per kg berat badan per jam oleh semua farmakope (Daneshiam, et al., 2006).


Efek fisiologis pirogen
Efek fisiologis pirogen pada manusia beragam dan bergantung pada dosis. Pertama, pirogen meningkatkan tingkat sirkulasi sitokin inflamasi (misalnya, IL-1, IL-6, TNFAlfa dan IL-8) diikuti oleh kejadian yang relevan secara klinis seperti demam, hipotensi, limfopenia, neutrofilia, dan peningkatan kadar kortisol plasma dan akut. -protein fase (misalnya, protein C-reaktif) (Forehand et al., 1989 dan Rietschel et al., 1994). Dosis rendah pirogen menyebabkan reaksi inflamasi tanpa gejala klinis, dan pirogen dosis sedang menyebabkan demam dan perubahan komposisi plasma dan pirogen dosis tinggi dapat menyebabkan syok septik yang ditandai dengan disfungsi kardiovaskular, termasuk depresi dan dilatasi miokardial, vasodilatasi, vasokonstriksi, dan disfungsi organ (misalnya ginjal, hati, paru, atau otak) yang diikuti oleh kegagalan banyak organ dan kematian. (Anspach, 2001; Erridge dan Bennett-Guerrero, 2002 dan Ogikubo, 2004)

TEKNIK PENENTUAN ENDOTOKSIN
Teknik yang disetujui FDA yang umum digunakan untuk deteksi endotoksin adalah uji pirogen kelinci dan uji Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (Hoffmann et al., 2005 dan Ding dan Ho, 2002). Uji pirogen kelinci, yang dikembangkan pada 1920-an, melibatkan pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah injeksi larutan uji secara intravena. Karena biayanya yang tinggi dan waktu penyelesaian yang lama, penggunaan uji pirogen kelinci telah berkurang, dan sekarang hanya diterapkan dalam kombinasi dengan uji LAL untuk menganalisis senyawa biologis pada fase pengembangan awal perangkat parenteral. Saat ini sistem deteksi endotoksin yang paling populer didasarkan pada LAL, yang berasal dari darah kepiting tapal kuda, Limulus polyphemus, dan gumpalan saat terpapar endotoksin. Bentuk paling sederhana dari uji LAL adalah uji bekuan gel LAL. Jika uji LAL dikombinasikan dengan pengenceran sampel yang mengandung endotoksin, gel akan terbentuk secara proporsional dengan sensitivitas endotoksin dari uji yang diberikan. Konsentrasi endotoksin diperkirakan dengan terus menggunakan uji dengan sensitivitas yang lebih rendah sampai reaksi negatif (tidak ada gumpalan yang dapat diamati) diperoleh. Prosedur ini membutuhkan waktu beberapa jam (Daneshiam et al., 2006 dan Ding dan Ho, 2002). Konsentrasi 0,5 EU / mL didefinisikan sebagai ambang batas antara sampel pirogenik dan nonpyrogenik (Pinto et al., 2000 dan Ding dan Ho, 2002). Selain teknik gel-clot, pabrikan juga telah mengembangkan dua teknik lain: teknik LAL turbidimetri dan teknik LAL kromogenik. Teknik yang lebih baru ini berbasis kinetik, yang berarti mereka dapat memberikan konsentrasi endotoksin dengan mengekstraksi respons real-time dari uji LAL. Uji LAL turbidimetri mengandung cukup koagulogen untuk membentuk kekeruhan ketika dibelah oleh enzim pembekuan, tetapi tidak cukup untuk membentuk bekuan (Ong et al., 2006). Uji turbidimetri LAL, jika dibandingkan dengan uji bekuan gel LAL, memberikan pengukuran endotoksin yang lebih kuantitatif pada rentang konsentrasi (0,01 EU / mL hingga 100,0 EU / mL). Pengujian ini didasarkan pada peningkatan kekeruhan akibat koagulasi protein terkait dengan konsentrasi endotoksin dalam sampel. Densitas optik berbagai pengenceran sampel uji diukur dan dikorelasikan dengan konsentrasi endotoksin dibantu oleh kurva standar yang diperoleh dari sampel dengan jumlah endotoksin yang diketahui (Sullivan dan Watson, 1974). Uji substrat kromogenik kinetik berbeda dari gel-bekuan dan reaksi turbidimetri karena koagulogen sebagian atau seluruhnya digantikan oleh substrat kromogenik (Haishima et al., 2003). Ketika dihidrolisis oleh enzim preclotting, substrat kromogenik melepaskan zat berwarna kuning yang dikenal sebagai p-nitroaniline. Waktu yang dibutuhkan untuk mencapai zat kuning berkaitan dengan konsentrasi endotoksin (Webster, 1980). Namun, uji turbidimetri dan kromogenik kinetik, meskipun lebih akurat dan lebih cepat daripada gel-clot, tidak dapat digunakan untuk cairan dengan kekeruhan yang melekat seperti darah dan cairan berwarna kuning, mis. urin, dan kinerjanya dapat dikompromikan oleh presipitasi dari larutan (Ong et al., 2006). Oleh karena itu, metode yang berbeda untuk mendeteksi endotoksin dalam sampel yang berbeda telah dipelajari (Ong et al., 2006 dan Poole et al., 2003

Uji hewan
Uji pirogen kelinci telah digunakan sejak 1940-an. Dalam tes ini, kelinci dikunci dalam pengekangan seluruh tubuh dan zat uji disuntikkan ke aliran darah mereka sementara suhu tubuh mereka dipantau melalui probe rektal. Hewan-hewan tersebut dapat menderita efek yang dapat berupa demam, gangguan pernapasan, kegagalan organ, dan gubuk yang fatal. Seperti semua pengujian berbasis hewan, pengujian kelinci memakan waktu, mahal dan memberikan hasil yang spesifik untuk spesies tertentu. Namun, uji kelinci secara ilmiah bermasalah dalam banyak hal tambahan. Bahkan pada volume injeksi tertinggi, batas deteksi uji kelinci di atas ambang batas demam manusia: manusia menunjukkan respons demam pada konsentrasi serendah 30pg LPS / ml sementara sensitivitas kelinci bervariasi antara 50 dan 350pg LPS / ml. Sebaliknya, tes IL-1 darah utuh manusia memiliki sensitivitas 10pg LPS / ml. Selain itu, sensitivitas uji kelinci bervariasi tergantung dari strain, umur dan jenis kelamin kelinci yang digunakan. Masalah penting lainnya termasuk fakta bahwa uji kelinci seringkali hanya memberikan jawaban lulus / gagal daripada jawaban kuantitatif; hasil tersebut dipengaruhi oleh kesusahan hewan serta variasi musiman. Terakhir, uji pirogenisitas kelinci tidak bekerja untuk banyak kelas zat termasuk kemoterapi, radiofarmasi, biologi dan antibiotik tertentu, obat-obatan yang menyebabkan sedatif / analgesik / anestesi, dan vitamin Limulus.

Uji Amoebocyte Lysate (LAL) Saat ini, metode pilihan untuk deteksi endotoksin dalam uji Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Tes ini didasarkan pada pengamatan bahwa darah karbohidrat tapal kuda membentuk colt ketika terkena endotoksin (Ding dan Ho 2001 dan Daneshiam et al., 2006). Ekstrak amoebosit dari darah karbohidrat tapal kuda dicampur dengan sampel yang diduga terkontaminasi endotoksin, dan reaksi diamati jika terdapat endotoksin. FDA telah menyetujui empat variasi uji LAL: uji gel-colt, turbidimetri, kolorimetri, dan kromogenik. Perbedaan variasi ini mengacu pada karakteristik reaksi amoebosit / endotoksin (misalnya gumpalan gel menghasilkan endapan dan perubahan warna kolorimetri). Tes ini cepat (sekitar 30 menit) dan sangat sensitif (sensitivitas hingga 0,005EU / ml). Namun, karena hanya mendeteksi endotoksin LPS, beberapa bahan pirogenik bisa terlewat. Selain itu, kondisi tertentu (kondisi pH yang kurang optimal atau konsentrasi kation yang tidak sesuai) dapat menyebabkan negatif palsu. Glukosa dari matriks kromatografi karbohidrat juga dapat menyebabkan hasil positif palsu.

Depirogenasi
Depirogenasi dapat didefinisikan sebagai penghapusan semua zat pirogenik, termasuk endotoksin bakteri dan umumnya dicapai dengan menghilangkan atau inaktivasi (FDA, 2010). Depirogenasi, seperti sterilisasi, adalah istilah absolut yang hanya dapat didemonstrasikan secara teoritis karena ketidakpekaan pengujian. Beberapa ilmuwan menganggap depirogenasi murni sebagai penghancuran atau inaktivasi endotoksin, dan pembuangan endotoksin sebagai proses yang berbeda dan tidak berhubungan. Di sini yang pertama mengacu pada inaktivasi atau penghancuran endotoksin yang ada pada suatu komponen, yang terakhir untuk menghilangkan setiap endotoksin yang ada (Williams, 1995). Dengan inaktivasi depirogenasi, diasumsikan kehancuran total "piroburden"; denganpemindahan endotoksin diasumsikan bahwa sebagian besar piroburden telah dipindahkan. Ilmuwan lain menganggap kedua proses tersebut sebagai bagian dari depirogenasi.

Penghapusan dan inaktivasi pirogen atau Penghancuran Pirogen seringkali sulit dihilangkan dari larutan karena variabilitas yang tinggi dari berat molekulnya. Pirogen juga relatif stabil secara termal dan tidak sensitif terhadap perubahan pH (Hirayama dan Sakata, 2002 dan Petsch dan Anspach, 2000). Namun, ada beberapa teknik (McCullough dan Novitsky, 1985; Weary dan Pearson, 1988; Hou dan Zaniewski 1990 dan Guy, 2003). Karena pirogen sering sulit dihilangkan, inaktivasi atau penghancuran molekul LPS kadang-kadang lebih disukai 1- Kromatografi penukar ion Endotoksin bermuatan negatif, dan akan terikat pada penukar anion. Jika substansi target tidak juga bermuatan negatif, ia akan melewati kolom sebelum endotoksin, dan pemisahan yang efektif dapat dicapai. Metode ini terkadang digunakan dalam pemurnian albumin (ikuti detailnya). Ligan yang memiliki afinitas yang diketahui terhadap endotoksin dapat digabungkan dengan sistem pertukaran anion untuk meningkatkan kekuatan pengikatan endotoksinnya dan selanjutnya meningkatkan pemurnian produk akhir. Contoh khas dari ligan pengikat endotoksin termasuk histamin, senyawa heterosiklik yang mengandung nitrogen, dan polimiksin B yang diketahui menginduksi produksi interleukin-1, suatu pyeogen eksogen dan karenanya harus terbukti tidak ada dalam produk akhir jika digunakan. Alternatif untuk pertukaran anion adalah kromatografi pertukaran kation, di mana zat terlarut bermuatan positif terikat pada media kromatografi padat. Dalam metode ini, target mengikat kolom, bukan endotoksin. Endotoksin kemudian dicuci melalui kolom, dan target murni kemudian dielusi dari kolom. Kromatografi pertukaran kation telah terbukti efektif memurnikan ß-interferon. (Dembinski et al., 1983). 2-Ultrafiltrasi Karena berat molekul endotoksin biasanya lebih dari 10 kD, ultrafiltrasi terkadang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan berdasarkan ukuran. Karena variabilitas ukuran endotoksin yang tinggi, mungkin sulit untuk memilih membran yang benar, oleh karena itu metode ini paling baik digunakan hanya jika semua endotoksin ada pada lebih dari 300.000 Da. Filter ultra yang tersedia secara komersial telah terbukti menghilangkan pirogen ke tingkat di bawah 0,001 EU / ml. 3-Distilasi Metode ini juga didasarkan pada berat molekul besar dan stabilitas panas endotoksin. Pelarut dengan berat molekul rendah dapat dengan mudah dimurnikan dengan merebus dan mengumpulkan uap kental dalam bejana bebas endotoksin. Molekul LPS yang besar tidak mudah menguap, sehingga tertinggal dalam wadah pemanas. Ini adalah metode pilihan untuk pemurnian air. Basa - Sodium hidroksida, Kalium hidroksida Senyawa pengoksigenasi - hidrogen peroksida, ozon, klorin dioksida Halida - Sodium hipoklorit, klorin Ini harus mencakup langkah pendinginan pasca-siklus aseptik untuk menghentikan proses sebelum dampak material yang merugikan. Metode hidrolisis asam-basa telah terbukti memecah Lipid A dari polisakarida dalam molekul LPS. Bagian lipid saja tidak larut dalam air. Karena tidak dapat mengikat ke sel endotel, ia menjadi tidak aktif. Namun, hidrolisis asam-basa dapat mengubah sifat protein target, dan karenanya tidak cocok saat memurnikan protein. Saat memurnikan protein, natrium hidroksida (NaOH) dapat digunakan dengan aman dan efektif. Ini juga banyak digunakan untuk depirogenasi peralatan yang tidak dapat diautoklaf (misalnya plastik) dan kolom kromatografi. Faktanya, saat menggunakan penukar anion atau menghilangkan pirogen, kolom dengan NaOH harus dibersihkan setelah setiap batch. Oksidasi menggunakan hidrogen peroksida sering digunakan sebagai larutan perusak pirogen berbiaya rendah. Mekanisme penghancuran ini tidak diketahui, tetapi hidrogen peroksida dapat dengan mudah dihilangkan lebih jauh ke hilir dalam proses pemurnian, dan oleh karena itu merupakan metode penghilangan pirogen yang berguna. Namun, seperti hidrolisis asam-basa, ini tidak cocok untuk pemurnian protein. Hidrogen peroksida fase uap (VPHP) adalah bahan gas sterilisasi yang relatif baru yang dengan cepat menjadi pensteril gas pilihan untuk banyak aplikasi, yang paling terkenal adalah sterilisasi sistem isolasi penghalang. Keunggulannya dibandingkan gas lain, seperti etilen oksida, asam perasetat, klorin dioksida, dan glutaraldehida, adalah sebagai berikut: 1. Tidak memerlukan suhu di atas ambien. 2. Ada sedikit atau tidak ada kekhawatiran tentang sisa produk sampingan. 8- Sterilisasi gas Gas etilen oksida (CH2) 2O yang reaktif secara kimiawi, dan formaldehida (metanal, H.CHO) memiliki aktivitas biosidal spektrum luas. • Aplikasi: sterilisasi instrumen bedah yang dapat digunakan kembali, peralatan medis, diagnostik dan listrik tertentu, dan sterilisasi permukaan serbuk. Perawatan etilen oksida juga dianggap sebagai alternatif untuk sterilisasi radiasi dalam produksi komersial perangkat medis sekali pakai. EtO lebih umum secara internasional daripada formaldehida. Perawatan etilen oksida (EO) banyak digunakan untuk sterilisasi perangkat medis. EO bertindak sebagai agen alkilasi kuat yang mengubah sifat asam nukleat dan protein fungsional mikroorganisme, sehingga menampilkan dirinya sebagai metodologi sterilisasi yang sangat baik (Mendes et al., 2007). Dalam hal kerugiannya, EO mudah terbakar dan mudah meledak, dan EO beserta residunya juga beracun dan karsinogenik (Mendes et al., 2007; Sílíndír dan Özer, 2009). Fungsi oleh substitusi nukleofilik dalam glukosomme dari Lipid -A. ini bukanlah proses depirogenasi yang paling efisien, dan di mana inaktivasi endotoksin terjadi, ini biasanya merupakan efek samping dari sterilisasi. 9-Radiasi pengion (Proses yang sangat lambat dan tidak konsisten) Sterilisasi dengan metode ini dicapai dengan paparan produk terhadap radiasi pengion dalam bentuk radiasi gamma dari sumber radioisotop yang sesuai (seperti kobalt 60 atau cesium 137) atau sinar elektron yang diberi energi oleh akselerator elektron yang sesuai. Keuntungan dari metode ini termasuk reaktivitas kimia yang rendah, residu yang dapat diukur yang rendah, dan fakta bahwa ada lebih sedikit variabel yang harus dikendalikan. Iradiasi hanya menyebabkan kenaikan suhu yang minimal, tetapi dapat mempengaruhi kualitas plastik dan kaca tertentu. 10-Panas lembab Autoklaf konvensional tidak akan merusak endotoksin. Namun, kombinasi bahan kimia tambahan (misalnya hidrogen peroksida) dan variasi fisik (misalnya lima jam pada 121 ° C dengan tekanan 20 PSI dan pH 3,8) terkadang efektif. Sebagai alternatif, beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa autoklaf untuk periode waktu yang lama atau pada suhu yang lebih tinggi dapat efektif dalam mengurangi endotoksin dan zat pirogen lainnya (Mosier et al., 1987 dan Moesby et al., 2008). Endotoksin dapat dinonaktifkan dengan panas basah, meskipun ini hanya efektif dengan konsentrasi endotoksin yang jauh lebih rendah dan diterapkan pada bahan yang tidak stabil terhadap panas. Penghancuran endotoksin jauh lebih sulit dicapai, dan pengurangan log yang lebih rendah jika dibandingkan dengan panas kering tercapai (Fujii, 2002). 11-Kering panas Kerusakan fisik, seperti konveksi (perpindahan panas dengan gerakan fluida atau udara), konduksi (perpindahan panas dari molekul yang berdekatan), atau iradiasi (emisi panas oleh radiasi elektromagnetik). Depirogenasi dengan panas kering untuk kaca dalam industri farmasi adalah metode penghancuran endotoksin utama yang digunakan (Nakata, 1993). Proses ini mensterilkan dan mendepirogenasi dan terutama digunakan untuk komponen kaca. Panas kering melibatkan komponen pada tingkat panas yang tinggi (biasanya antara 180 dan 250 ° C) untuk waktu yang ditentukan (semakin tinggi suhu, semakin pendek waktu yang dibutuhkan). Siklus biasa adalah 250 ° C selama tidak kurang dari 30 menit. Misalnya, Farmakope Eropa dalam bab 2.6.8 menyatakan kemungkinan kombinasi suhu waktu untuk dypyrogenation: 60 menit pada 200 ° C atau 30 menit pada 250 ° C. Sejumlah endotoksin yang dihancurkan pada suhu 250 ° C selama 60 menit belum tentu hancur total pada suhu 200 ° C pada 60 menit, berdasarkan non-linearitas kurva penghancuran termal. Penghancuran endotoksin pada suhu rendah adalah urutan kedua (Ludwig dan Avis, 1990)
onclusion Depirogenasi merupakan bagian dari proses kritis di banyak fasilitas produksi farmasi, terutama di mana botol dan botol kaca diperlukan untuk memeriksa operasi pengisian. Tidak boleh dilupakan, bahkan mencapai depirogenasi yang berhasil, bahwa pyroburden yang menimbulkan risiko farmasi berasal dari kombinasi bahan mentah, air, bahan aktif, lingkungan, dan bahan pengemas primer. Risiko endotoksin atau kontaminasi pirogenik lainnya dapat timbul dari berbagai sumber dan tidak hanya dari wadah akhir saja. Ultrafiltrasi bahan kimia dan larutan penyangga, menerapkan praktik higienis yang sesuai, dan melakukan pengujian rutin semuanya dapat membantu